Um diagnóstico rápido de SARS-CoV-2 usando formação de hidrogel de DNA em poros microfluídicos

Para atender às demandas relativas ao enfrentamento da COVID-19, o trabalho apresenta um biossensor microfluídico, portátil, rápido e ultrassensível. O sistema pode ser utilizado no local de atendimento e é capaz de detectar seletivamente SARS-CoV-2 em poucos minutos, com excelente limite de detecção (LOD).

Com a semelhança entre sintomas da COVID-19 e da gripe comum, o diagnóstico precoce requer análises laboratoriais rápidas, de alta precisão molecular e de baixo custo. Muitas estratégias que foram introduzidas, como a transcrição reversa seguida de reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (RT-qPCR) e a detecção baseada em anticorpos, apresentam limitações, tais como a baixa sensibilidade dos imunoensaios e sua dependência de anticorpo específico, além da complexidade laboratorial da RT-qPCR. Assim, o desenvolvimento de metodologia para detecção rápida, precisa, de baixo custo, para diagnóstico no local de atendimento, é uma demanda relevante para o manejo da COVID-19.

O desenvolvimento de várias técnicas de amplificação isotérmica, como a mediada por loop (LAMP), o processo de amplificação inteligente, a amplificação em círculo rolante (RCA), foi impulsionado devido ao desempenho, rapidez, sensibilidade, e quantificação confiável. Estudos recentes usando LAMP para detecção de COVID-19 indicaram duração e LOD inadequados. Apesar de progressos do RCA com o emprego de sonda cadeado, em forma de haltere, as investigações apresentaram limitações de tempo e de LOD. O presente trabalho descreve um sistema microfluídico inovador, para detecção rápida e ultrassensível de SARS-CoV-2 em tempo curto, utilizando muito baixas concentrações de DNA.

O estudo envolve várias etapas validadas. A imobilização de primers na superfície de uma rede de náilon permitiu sua combinação a uma sonda fluorescente, produzindo imagens brilhantes. O tubo ao qual a rede é afixada conecta-se à plataforma microfluídica e, via RCA, forma-se um hidrogel de DNA que bloqueia os microporos da malha fina e interrompe o fluxo de microflúidos hidrostáticos sensíveis. A viscosidade foi avaliada por reometria microfluídica. Para confirmar a especificidade da detecção do patógeno, dois modelos de vírus diferentes (SARS-CoV-2 e vírus da dengue) foram examinados com a sonda cadeado.

Um biossensor microfluídico portátil, rápido e ultrassensível foi projetado para detecção específica de COVID-19.  O sistema microfluídico equipado com um tubo contendo modelo de DNA de SARS-CoV-2, com incubação do patógeno COVID-19 por 30 min, gerou, por RCA, hidrogel de DNA suficiente para interromper o fluxo, que não se alterou para outros patógenos comparativamente mediante o mesmo tempo de incubação. Os resultados indicam que o sistema desenvolvido pode detectar seletivamente SARS-CoV-2, sem reação cruzada com DNA de outros patógenos, alcançando LOD de 3 attomols de DNA por litro após 15 min de análise, ou 30 attomols por litro após 5 min.

O desempenho da técnica RCA foi maximizada para detectar COVID-19 com o emprego de uma rede onde o gel de DNA é formado, bloqueando rápida e facilmente o fluxo no tubo conectado à malha. Com área de superfície mínima e homogeneização contínua, maior número de moléculas do patógeno são anexadas. A alta densidade da rede reduz drasticamente a quantidade de hidrogel de DNA necessária para bloquear o fluxo, possibilitando detectar SARS-CoV-2 com LOD excelente em poucos minutos. O sistema microfluídico portátil desenvolvido pode ser utilizado em aeroportos e outros locais de maior disseminação de doenças infecciosas.